载体构建时可能出现的问题有哪些？

（1）双酶切时使用错误的酶；
（2）双酶切选择两个酶切位点距离过近；
（3）酶切产生的粘性末端可以互补；
（4）使用了对甲基化敏感的限制性内切酶，如Dpnll；
（5）宿主菌选择不恰当，如在Gateway克隆中使用含F质粒的菌株；
（6）使用高拷贝数的骨架来克隆大片段，如质粒相对拷贝数高但装载量最高为30 kb，AAV最小为4.7 kb同时相对拷贝数较高，慢病毒相对拷贝数第但装载可稳定在9,2 kb。