稳定整合试验中需要考虑的几个关键因素有：1）外源插入片段的拷贝数，2）外源基因整合的几率，3）整合位点的转录活跃度，4）整合后的稳定性，5）使用混合稳定株或者获得多个不同单克隆稳定株。

1）纯化RNA
在转染前要确认RNA的大小和纯度。为得到高纯度的RNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。
2）避免RNA酶污染
微量的RNA酶将导致RNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等，此保证实验每个步骤不受RNA酶污染非常重要。
3）健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性
通常，健康的细胞转染效率较高。此外，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验，推荐用50代以下的转染细胞，否则细胞转染效率会随时间明显下降。

1）转染试剂
    不同细胞系转染效率通常不同，但细胞系的选择通常是根据实验的需要，因此在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。
2）细胞生长状态
    一般低的细胞代数（<50）能确保基因型不变。最适合转染的细胞是经过几次传代后达到指数生长期的细胞，细胞生长旺盛，最容易转染。
3）转染方法
    因不同实验室培养的细胞性质不同，质粒定量差异，操作手法上的差异等，其转染效果可能不同，应根据实验室的具体条件来确定最佳转染条件。
4）载体结构
    转染载体的构建（病毒载体，质粒DNA，RNA，PCR产物，寡核苷酸等）影响转染结果。除载体构建外，载体的形态及大小对转染效率也有不同的影响。

1）增强剂用量过大，可适当减少其用量；
2）病毒量过大，可适当减少病毒用量，可采用更换培养基或增加培养基量的方法。

1）根据细胞增殖速度决定接种量，一般需保证感染后4天左右细胞刚好快长满培养皿底部。
2）对于大部分细胞系：传代周期2-3天，感染时细胞铺板密度保持在20%-30%范围内。
3）对于某些原代细胞：细胞生长缓慢，接种时汇合度可提升至50%-60%，保证感染后4天左右细胞汇合度达到90%-100%。
4）对于非分裂细胞：接种后不再增殖（如神经元细胞），按照汇合度100%进行接种。

一般是病毒对细胞具有一定毒性，可调整、降低感染MOI值。并密切关注细胞状态，在感染后4、8、12小时定时观察细胞情况。若出现细胞状态变差情况，立即对细胞进行换液处理，使用新鲜的完全培养液替换病毒感染培养液。

病毒感染效率受多个因素影响，包括细胞自身生长状态、细胞数量、细胞被感染的难易程度等。因此在实验过程中，保证细胞正常增殖、轮廓清晰，同时保持合适的细胞密度，选择最佳感染条件可更好保证感染效率。
对于悬浮细胞，可采用离心感染的方法，减少病毒感染时的体积，从而提高感染效率。如培养板密封，可用平角转子离心机1000 g离心1 hrs，再放回培养箱中继续正常培养。

GFP病毒感染细胞后，细胞荧光强度取决于病毒进入细胞颗粒数、细胞本身的增殖状态、细胞类型、观察时间、GFP基因启动子活性等因素。因此，目的细胞感染病毒颗粒数越多、细胞增殖越快，GFP荧光会较强。
其次，病毒在增殖较快的细胞中感染96-120 hrs后，GFP蛋白表达才达到峰值；在增殖较慢的细胞中，这一时间更长。
此外，强启动子后的GFP基因荧光表达强，反之，弱启动子后面的荧光表达较弱。

若电转效果不佳，可考虑一下条件进行优化：
1. 电场参数
    不同细胞系具有不同的最佳场强值，其确定方法除了实验直接测定比较不同场强下转染率的高低外，还可以采取较为简便的间接法。文献显示存活率在50%左右的电场参数为理想参数，故可间接测定存活率来确定最佳场强值。
2. 脉冲过程
    ①脉冲波形主要分为两种，方波脉冲和指数递减波脉冲。一般哺乳动物细胞电转选择方波脉冲，细菌、酵母菌、昆虫细胞选择指数递减波脉冲。
    ②脉冲时间的选定主要取决与脉冲波形。在方波脉冲中，脉冲时间可直接设定。在指数递减波脉冲中，脉冲时间是指电压衰减至初始电压1/3时所用的时间，等于电容（C）与电阻（R）的乘积，单位是ms。在参数优化中，增加电压应当降低脉冲时间，而减小电压则应当增大脉冲时间。
    ③一般而言，对于大多数细胞类型都选择单次脉冲。而在有些情况下可能会用到多次脉冲，因为低电压、短脉冲时间、多次脉冲可有效避免细胞损伤。多次脉冲建议中间间隔1min。
3. 细胞因素
    用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞（15代以内，传代后2d）。细胞悬液浓度一般为1*10⁶/ml，当细胞生长密度大于3*10⁶/ml，转染效率会下降。
4. 质粒因素
    从质粒浓度看，细胞密度为1*10⁶/ml，DNA用量在2-5 μg/ml转染效率最高。
5. 温度
    一般情况下，电转的过程是在室温下进行，但在电击前后需对细胞进行冰浴处理。
6. 电转后培养液的选择
    细胞在电击后十分脆弱，其培养液的选择应注重提高细胞的存活率，一般选择 低渗的RPMI 1640+10％FCS。除此之外，可参考加入50 mmol／L海藻糖+1.25％DMSO。