学习中心 / 常见问题 / 细胞实验 当前位置:主页 > 学习中心 > 常见问题 > 细胞实验 >
  • Q.细胞转染实验影响因素有哪些?

    A.答案
    1)转染试剂
        不同细胞系转染效率通常不同,但细胞系的选择通常是根据实验的需要,因此在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。
    2)细胞生长状态
        一般低的细胞代数(<50)能确保基因型不变。最适合转染的细胞是经过几次传代后达到指数生长期的细胞,细胞生长旺盛,最容易转染。
    3)转染方法
        因不同实验室培养的细胞性质不同,质粒定量差异,操作手法上的差异等,其转染效果可能不同,应根据实验室的具体条件来确定最佳转染条件。
    4)载体结构
        转染载体的构建(病毒载体,质粒DNA,RNA,PCR产物,寡核苷酸等)影响转染结果。除载体构建外,载体的形态及大小对转染效率也有不同的影响。
  • Q.病毒感染细胞实验中,使用感染增强剂出现细胞毒性的原因是什么?

    A.答案
    1)增强剂用量过大,可适当减少其用量;
    2)病毒量过大,可适当减少病毒用量,可采用更换培养基或增加培养基量的方法。
  • Q.用于病毒感染的细胞接种量多少为宜?

    A.答案
    1)根据细胞增殖速度决定接种量,一般需保证感染后4天左右细胞刚好快长满培养皿底部。
    2)对于大部分细胞系:传代周期2-3天,感染时细胞铺板密度保持在20%-30%范围内。
    3)对于某些原代细胞:细胞生长缓慢,接种时汇合度可提升至50%-60%,保证感染后4天左右细胞汇合度达到90%-100%。
    4)对于非分裂细胞:接种后不再增殖(如神经元细胞),按照汇合度100%进行接种。
  • Q.加入病毒后,细胞死亡严重,是什么原因?该如何处理?

    A.答案
    一般是病毒对细胞具有一定毒性,可调整、降低感染MOI值。并密切关注细胞状态,在感染后4、8、12小时定时观察细胞情况。若出现细胞状态变差情况,立即对细胞进行换液处理,使用新鲜的完全培养液替换病毒感染培养液。
  • Q.如何提高病毒感染效率?

    A.答案
    病毒感染效率受多个因素影响,包括细胞自身生长状态、细胞数量、细胞被感染的难易程度等。因此在实验过程中,保证细胞正常增殖、轮廓清晰,同时保持合适的细胞密度,选择最佳感染条件可更好保证感染效率。
    对于悬浮细胞,可采用离心感染的方法,减少病毒感染时的体积,从而提高感染效率。如培养板密封,可用平角转子离心机1000 g离心1 hrs,再放回培养箱中继续正常培养。
  • Q.细胞能被病毒感染,但为什么GFP荧光很弱?

    A.答案
    GFP病毒感染细胞后,细胞荧光强度取决于病毒进入细胞颗粒数、细胞本身的增殖状态、细胞类型、观察时间、GFP基因启动子活性等因素。因此,目的细胞感染病毒颗粒数越多、细胞增殖越快,GFP荧光会较强。
    其次,病毒在增殖较快的细胞中感染96-120 hrs后,GFP蛋白表达才达到峰值;在增殖较慢的细胞中,这一时间更长。
    此外,强启动子后的GFP基因荧光表达强,反之,弱启动子后面的荧光表达较弱。
  • Q.电穿孔转染效果不佳,其影响因素可能有哪些?

    A.答案
    若电转效果不佳,可考虑一下条件进行优化:
    1. 电场参数
        不同细胞系具有不同的最佳场强值,其确定方法除了实验直接测定比较不同场强下转染率的高低外,还可以采取较为简便的间接法。文献显示存活率在50%左右的电场参数为理想参数,故可间接测定存活率来确定最佳场强值。
    2. 脉冲过程
        ①脉冲波形主要分为两种,方波脉冲和指数递减波脉冲。一般哺乳动物细胞电转选择方波脉冲,细菌、酵母菌、昆虫细胞选择指数递减波脉冲。
        ②脉冲时间的选定主要取决与脉冲波形。在方波脉冲中,脉冲时间可直接设定。在指数递减波脉冲中,脉冲时间是指电压衰减至初始电压1/3时所用的时间,等于电容(C)与电阻(R)的乘积,单位是ms。在参数优化中,增加电压应当降低脉冲时间,而减小电压则应当增大脉冲时间。
        ③一般而言,对于大多数细胞类型都选择单次脉冲。而在有些情况下可能会用到多次脉冲,因为低电压、短脉冲时间、多次脉冲可有效避免细胞损伤。多次脉冲建议中间间隔1min。
    3. 细胞因素
        用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞(15代以内,传代后2d)。细胞悬液浓度一般为1*106/ml,当细胞生长密度大于3*106/ml,转染效率会下降。
    4. 质粒因素
        从质粒浓度看,细胞密度为1*106/ml,DNA用量在2-5 μg/ml转染效率最高。
    5. 温度
        一般情况下,电转的过程是在室温下进行,但在电击前后需对细胞进行冰浴处理。
    6. 电转后培养液的选择
        细胞在电击后十分脆弱,其培养液的选择应注重提高细胞的存活率,一般选择 低渗的RPMI 1640+10%FCS。除此之外,可参考加入50 mmol/L海藻糖+1.25%DMSO。
  • Q.siRNA导入细胞有哪些方法,哪种最好?

    A.答案
    siRNA导入细胞有以下几种方法:化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。选择时应该依据实验条件考虑以下因素:细胞对转入方式的承受能力、细胞对病毒侵染的易感性、细胞的生长特性等。对贴壁细胞来说化学转染技术是最为常用的方法,而对悬浮细胞则采用电穿孔法效果较好。
  • Q.体内转染(Entranster-in vivo)效果如何检测?

    A.答案
    一般根据课题研究要求进行,如果单纯检测转染效率,推荐用qRT-PCR方法和luciferase方法。还可根据研究,采用组织学和生理学,以及物理测量的方法进行。由于体内转染的复杂性,通常体外试验中常采用的转染GFP蛋白用荧光显微镜观察的方法,由于体内取出的组织材料背景高,检测较为困难。
  • Q.影响siRNA转染效率的因素有哪些?

    A.答案
    1)RNA与转染试剂比例不佳
    由于RNA序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记,决定了RNA和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件,建议先进行预实验优化。
    2)细胞密度不佳
    调整细胞密度到转染时汇合度为20-40%。成功转染siRNA的细胞会产生目标基因表达下调,但未成功转染的细胞却不受影响,这时转染效率和总的细胞数量就很重要,一般细胞数量较少时转染效率高。由于siRNA沉默时效性的影响,转染后48小时才能进行进行qRT-PCR检测,转染后48-72小时才能进行蛋白检测。如果转染时铺板密度较高,细胞一方面转染效果不理想,直接影响沉默效果和数据可靠性,另一方面,48小时甚至更长时间后,沉默检测最佳点时,过于密集的细胞将影响细胞状态,从而影响实验结果。
    3)RNA效率不高
    选择最优RNA,并采用已知高效的RNA做对照。siRNA的合成需要注意的是一定要选用高纯度的siRNA,siRNA的纯度直接关系到转染效率和沉默效率。

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