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  • Q.如何判断DNA质量/纯度?

    A.答案
    人们通常使用260nm和280nm(A260/A280)的吸光度比值来衡量样本纯度。对于DNA而言,理想的比值为1.8,容许的范围在1.7-1.9之间。同时,A260/A230的比值也可用于检验样品是否存在其他物质的污染。DNA分子的理想比值范围在1.8-2.0。DNA的纯度也可通过琼脂糖凝胶电泳来检验。例如若是基因组DNA,需要观察长片段的平均大小。若是质粒DNA,应出现一条明显的单一条带(可能会出现几条额外条带,代表质粒分子的多种形式)。
  • Q.设计稳定株构建实验需要考虑的因素有哪些?

    A.答案
    稳定整合试验中需要考虑的几个关键因素有:1)外源插入片段的拷贝数,2)外源基因整合的几率,3)整合位点的转录活跃度,4)整合后的稳定性,5)使用混合稳定株或者获得多个不同单克隆稳定株。
  • Q.如何提高RNA细胞转染效率?

    A.答案
    1)纯化RNA
    在转染前要确认RNA的大小和纯度。为得到高纯度的RNA,推荐用玻璃纤维结合,洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸,小的寡核苷酸,蛋白和盐离子。注意:化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化(即PAGE胶纯化)。
    2)避免RNA酶污染
    微量的RNA酶将导致RNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在,如皮肤,头发,所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等,此保证实验每个步骤不受RNA酶污染非常重要。
    3)健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性
    通常,健康的细胞转染效率较高。此外,较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验,推荐用50代以下的转染细胞,否则细胞转染效率会随时间明显下降。
  • Q.载体构建时可能出现的问题有哪些?

    A.答案
    (1)双酶切时使用错误的酶;
    (2)双酶切选择两个酶切位点距离过近;
    (3)酶切产生的粘性末端可以互补;
    (4)使用了对甲基化敏感的限制性内切酶,如Dpnll;
    (5)宿主菌选择不恰当,如在Gateway克隆中使用含F质粒的菌株;
    (6)使用高拷贝数的骨架来克隆大片段,如质粒相对拷贝数高但装载量最高为30 kb,AAV最小为4.7 kb同时相对拷贝数较高,慢病毒相对拷贝数第但装载可稳定在9,2 kb。
  • Q.RNAi介导的基因下调和CRISPR基因组编辑介导的基因敲除,哪种方法更好?

    A.答案
    这取决于具体实验目的。其中在不需要改变遗传密码时,RNAi介导的基因下调比基因组编辑更适用。但是,要使染色体上产生一个真正无效的等位基因,采用CRISPR基因组编辑方法更佳。
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