稳定整合试验中需要考虑的几个关键因素有：1）外源插入片段的拷贝数，2）外源基因整合的几率，3）整合位点的转录活跃度，4）整合后的稳定性，5）使用混合稳定株或者获得多个不同单克隆稳定株。

1）纯化RNA
在转染前要确认RNA的大小和纯度。为得到高纯度的RNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。
2）避免RNA酶污染
微量的RNA酶将导致RNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等，此保证实验每个步骤不受RNA酶污染非常重要。
3）健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性
通常，健康的细胞转染效率较高。此外，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验，推荐用50代以下的转染细胞，否则细胞转染效率会随时间明显下降。

（1）双酶切时使用错误的酶；
（2）双酶切选择两个酶切位点距离过近；
（3）酶切产生的粘性末端可以互补；
（4）使用了对甲基化敏感的限制性内切酶，如Dpnll；
（5）宿主菌选择不恰当，如在Gateway克隆中使用含F质粒的菌株；
（6）使用高拷贝数的骨架来克隆大片段，如质粒相对拷贝数高但装载量最高为30 kb，AAV最小为4.7 kb同时相对拷贝数较高，慢病毒相对拷贝数第但装载可稳定在9,2 kb。