世界肝炎日 | 新靶点!SART1基因在HBV感染期间的抗病毒作用!

时间:2021-07-28 14:54

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肝炎(Hepatitis)是肝脏的炎症,其造成原因不同,常见的是病毒导致的,此外还有自身免疫造成的,酗酒也可以导致肝炎。由病毒造成的肝炎按照其病毒系列不同分为六种类型,其中乙型肝炎由乙型肝炎病毒(HBV)感染导致。虽有疫苗和治疗方法,但目前乙型肝炎仍不能完全治愈。

 

感染HBV,病毒进入肝细胞后,病毒衣壳释放它的基因组,一个松弛的环状DNA (rcDNA)进入肝细胞的细胞核。然后将rcDNA转化为共价闭合的环状DNA(cccDNA),作为病毒RNA转录的模板。这一过程是抗病毒治疗的主要障碍。

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图1. HBV生活周期(PMID: 30282709)

 

今年7月Journal of Hepatology(IF:25.083)上刊登的文章《Novel function of SART1 in HNF4α transcriptional regulation contributes to its antiviral role during HBV infection》中,作者通过使用各种HBV模型,描绘了SART1通过调控部分干扰素刺激基因(ISGs)的表达来发挥其抗HBV活性,为抗HBV研究打开了一扇窗。

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图2. 登刊信息

 

 

既往研究表明,SART1通过对ISGs的调控来抑制丙型肝炎病毒(HCV)的感染,故作者推测SART1对HBV感染也可能具有相同的作用。

 

因此,在这篇文章中,作者先检查了SART1对HBV复制的作用。作者通过慢病毒建立SART1干扰和过表达的HepG2-NTCP细胞,观察其HBV表达水平。结果显示,过表达SART1显著抑制了HBV复制标记物表达,包括HBeAg、HBsAg、HBV DNA以及细胞内HBc和pgRNA,但cccDNA未受影响(见图3)。反之,下调SART1水平后,上述各指标水平均明显升高,cccDNA同样未受影响。

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图3. SART1对HBV感染的影响

 

 

那么,SART1基因是如何在肝细胞中抑制HBV复制的呢?于是,接下来作者研究了其中的分子机制。

 

既往研究提示,SART1通过直接转录调控一些ISGs和选择性剪接IEGs来发挥其抗HCV活性。因此作者观察了HepG2-NTCP细胞中SART1表达对ISGs和IEGs水平的影响。siRNAs 介导的SART1敲低显著降低了某些经典ISGs(包括MX1和ISG15)的表达,SART1敲除也可以降低IEGs的表达(见图4)。

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图4. SART1干扰/敲除对ISGs水平的影响

 

 

为了研究SART1是否通过HCV相同的途径影响HBV感染,作者使用络氨酸激酶(JAK)抑制剂(竞争性地结合到JAK1/3激酶的催化区域)以阻断下游ISGs的表达。结果提示,JAK抑制剂阻断了ISGs的表达,但对SART1表达没有影响,同时仍能增加HBV复制标记物HBeAg、HBsAg、HBV DNA、HBV pgRNA和HBV核心蛋白的水平(见图5)。干扰素(IFN)α和β受体亚基2(IFNAR2)敲除的实验也验证了这一结果。

这些结果证明了,SART1可以独立于其对ISGs表达的调控来调控HBV复制

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图5. SART1抑制HBV复制不依赖于IFN途径

 

 

既然,SART1可以独立于IFN的方式抑制HBV复制。那么是什么途径对其有调节作用呢?

 

为了剖析SART1发挥其抗HBV作用的机制,作者首先评估了其对不同HBV启动子的作用。相对表达水平验证显示,敲除SART1 显著增强了HBV核心启动子和X启动子的活性,但不影响pre-S1或pre-S2/S启动子。反之,过表达SART1则明显抑制了HBV核心启动子活性,但对HBV pre-S1或pre-S2/S和X启动子无影响。同样的,JAK抑制剂处理后,SART1敲低仍可增强HBV核心启动子或X启动子的活性。

这些数据表明,SART1能够以IFN通路独立的方式抑制HBV启动子活性

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图6. SART1对不同HBV启动子的作用

 

 

为了探讨SART1与cccDNA的相互作用是否具有调节作用,作者用HBV感染稳定过表达SART1的HepG2-NTCP细胞,并进行cccDNA ChIP实验。如下图7显示,只有组蛋白H3与cccDNA相关,而SART1与cccDNA无关

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图7. SART1与cccDNA相关性分析

 

 

随后,作者验证了SART1对调控HBV启动子激活的转录因子的作用。结果显示,敲除/过表达SART1显著改变了HNF4α mRNA水平,同时这种改变降低了HNF4α与cccDNA的相关性(见图8)。为了证实这一作用,作者使用AAV介导对HNF4α结合位点进行突变,与预期的一样,突变组的HBV总复制水平为比野生型低。因此,作者得出结论:SART1可以独立于IFN通路特异性抑制HNF4α的表达,以此抑制HBV核心启动子的活性

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图8. SART1对HBV转录因子HNF4α表达的调节作用

 

 

下一步,作者进行体内回复实验。AAV介导的验证实验显示,小鼠模型上能够重复体外实验结果,即SART1敲低/过表达能够影响HNF4α的表达和HBV的复制。

 

 

最后,作者探讨了SART1如何限制HNF4α转录的机制。qRT-PCR结果显示,SART1的下调显著增加了HNF4α及其选择性剪切典型异构体α1、α2、α7、α8的mRNA水平。然而,HNF4α亚型之间没有差异,这说明SART1不能影响HNF4α mRNA的剪接

 

另一种假说中,HNF4α转录调控通过与其启动子的直接相互作用完成。因此,作者研究了SART1对成人肝脏中调控HNF4α转录的P1启动子的影响。结果显示,下调SART1显著提高了HNF4α P1启动子的活性。其后ChIP检测证实,SART1被招募到HNF4α近端P1 启动子区域(-500-0)。然后通过超声切割染色质至约100 bp/20 bp,对P1启动子不同区域进行ChIP PCR。如下图9显示,SART1与HNF4α P1启动子在∆309-288处相关联。综上所述,SART1通过与HNF4α近端P1启动子(-309到-288)区域相关联来限制HNF4α的表达

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图9. SART1对HNF4α启动子的影响
 

总之,以上数据表明SART1通过抑制HNF4α来限制HBV cccDNA 的转录。需要进一步的研究来确定是否SART1可用于抑制慢性乙型肝炎患者中的HBV,并评估SART1在抗HBV治疗中的潜在作用。更详细地了解调节这一过程的机制,不仅将推进我们对HBV基本病毒学的知识,而且还有助于发现新的抗病毒靶点,推动未来发展实现HBV治愈的方法。

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时间:2021-07-28 14:54来源:未知 作者:admin8 点击: