小布解读 | 比单身狗更亮？--HSV增亮版HBEGFP！！

一年一度的七夕情人节又来到了。去年盛行孤寡青蛙，今年单身狗们还能创造出什么新梗呢？其实比起电灯泡们，神经环路示踪分析中还有更亮的荧光蛋白。

实验中我们常使用嗜神经病毒，对神经环路结构和功能进行追踪分析。其中单纯疱疹病毒1型（HSV）的H129株被广泛应用于顺行示踪，但其仍受基因表达水平较低和毒性较高的限制，通常需要短时间内取样以避免动物死亡，并通过免疫组化以放大荧光信号。

为了解决低灵敏度的问题，已经使用了几种不同的方法以增强荧光蛋白的表达，包括使用强启动子、表达调控因子或将荧光蛋白编码基因的几个拷贝插入病毒基因组中。然而，这些方法受HSV本身的限制，只增加了有限数量的转基因拷贝，限制了荧光蛋白的表达。

苏鹏博士2020年发表的文章《High-brightness anterograde transneuronal HSV1 H129 tracer modified using a Trojan horse-like strategy》中应用特洛伊木马样策略，整合HSV和AAV复制系统，增强了HSV外源基因表达水平，可以更方便和灵活地应用于神经元顺行示踪。

图1. DOI：10.1186/s13041-020-0544-2

首先，作者通过在H129株基因组引入AAV复制系统（ITRs和Rep）构建嵌合病毒，以增强外源基因（EGFP）的表达，标记为H8。与常规HSV（H1）的区别，体内外结果均显示，H8荧光基因组拷贝数和蛋白表达水平更高。另外在小鼠的VTA中分别注射H8和H1，3天后采集全脑成像。脑切片证实H8病毒的EGFP表达明显高于H1，即使肉眼的差异也很明显。这说明，H8病毒在脑内注射后可有效且高荧光强度地标记神经元。

图2. H8神经环路标记

基于野生型H129构建的重组H1常被用作神经元顺行示踪剂，那么改造后的H8还能如H1一样完成顺行示踪吗？

为了验证这一怀疑，作者在小鼠V1（初级视觉皮层）注射了H1和H8。三天后收集小鼠大脑进行成像。如图3可见，均在V1及其下游（上丘SC、外侧膝状体核LGN和尾状核CPU）均发现GFP+细胞体。因此，H8也可以作为顺行示踪剂。

图3. H1和H8在体顺行示踪

随后，作者又进一步分析了H8在更短的时间内对神经环路标记的效率，发现：

注射24h后，仅在注射位点观察到荧光；38h后，在许多离散的大脑区域均观察到荧光，包括AON、ORB、AI、Pir、SI、PVN、AMY、ENT、HIP、VTA等；48h后，在更广泛的大脑区域检测到荧光，包括LHA、DRN和大脑皮层的大部分。

因此，H8能够沿着神经环路通过多个突触顺行传递，感染和标记大脑皮层。

图4. H8在不同时间框架内追踪NAC输出通路的标记效率

同时，作为对照，作者又检测了注射36h后H1的标记情况。此时，H1也标记了所有被H8标记的大脑区域，但EGFP的荧光强度远低于H8。

图5. H1和H8注射36h后对大脑皮层标记情况比较

值得关注的是，感染H8的小鼠行为变化更温和，这可能是因为H8的复制速度比H1更慢，并且诱导的炎症反应也较弱。

H8是一种亮度更高、毒性更低、使用更灵活的神经环路顺行示踪剂，可在无免疫染色情况下被利用。

香港宝典免费资料网最新测试结果显示，基于上述HSV株改造的产品HSV-HBEGFP具有相较于常规HSV更高的亮度。

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