小布新品｜新一代严格顺行跨单级突触示踪病毒Hs06来啦！

神经解剖学追踪技术是解开大脑连接体复杂网络的基础。目前神经元之间传播的示踪工具，特别是严格的顺行跨单突触示踪剂仍然缺乏。HSV1株H129的突变体H129-ΔTK已被应用于顺行跨单突触示踪剂，然而H129有一个严重的缺陷，它可通过轴突末梢感染神经元。因此使用H129解析输出神经环路时，应仔细考虑其逆向感染带来的干扰。消除H129的神经轴突末梢吸收，实现H129的严格顺行跨单突触示踪非常重要。

中国科学院深圳先进技术研究院徐富强课题组报道了一种基于重组病毒H129的严格而实用的顺行跨单突触示踪剂，它在囊膜糖蛋白D（gD）中携带抗人表皮生长因子受体2(Her2)的单链抗体（scFv）以靶向特异类型神经元，通过使用互补表达Her2和gD的辅助病毒，可以实现特定脑区及神经元类型的直接投射网络追踪。相关工作发表于bioRxiv《Rigorous anterograde trans-monosynaptic tracing of genetic defined neurons with retargeted HSV1 H129》一文中。

作者首先将构建的穿梭载体pHs01与H129病毒共转染BHK细胞系，获得gD缺失的H129株Hs01病毒（H129ΔgD-tdTomato）；进一步将Hs01病毒与载体pHs06（phUbc-mCherry-T2A-scHer2/gD-WPRE-pA）共转染BHK-Her2细胞系中，获得Hs06病毒（H129ΔgD-hUbC-mCherry-P2A-scHer2::gd-WPRE-bGH polyA）。Hs06具有靶向Her2受体的特异，同时细胞感染实验表明Hs06也可特异性识别缩短的Her2受体（Her2CT9）。由于动物中枢神经系统神经元几乎不表达Her2受体，因而消除了H129的轴突末端感染能力。

图1. 构建及鉴定gD 缺失及靶向Her2的H129

Hs06进入初始神经元后如何跨突触感染下一级神经元呢？通过设计Hs06辅助病毒AAV-UL26.5p -DIO-cmgD-WPRE-pA，在神经元中补偿密码子优化gD蛋白（cmgD），可实现Hs06病毒跨突触传播。同时设计携带Her2CT9元件的辅助病毒，实现Hs06病毒特异性感染。将两种辅助病毒提前注射到靶脑区，待Her2CT9和EGFP表达量足够后，将Hs06病毒再次注射到相同的位置。Hs06通过识别Her2CT9进入神经元，然后用辅助病毒提供的gD表达元件完成对子代的包装，实现顺向跨突触传播。

图2. AV Helper的构建及Hs06顺行跨单突触示踪策略

Hs06在体内是否仍具有感染特异性呢？作者在D2R-Cre或C57BL/6小鼠伏隔核(Nac)脑区分别注射了PBS和辅助病毒AAV-hSyn-DIO-EGFP-T2A- Her2CT9，两周后原位注射Hs06，5天后，收集脑组织切片进行观察。结果表明，实验组小鼠脑内Nac及邻近区可见到大量Hs06 感染的神经元，而对照组未观察到红色神经元(图3c)。因此进一步证实Hs06与Her2CT9具有较高的亲和力，Hs06病毒可在体内能高效、特异地感染表达Her2CT9的神经元。

图3. Hs06在体内的感染效率和特异性

为进一步验证Hs06的顺行传播的能力。作者在小鼠大脑的初级视觉皮层(V1)进行了示踪实验。首先，将病毒AAV-UL26.5p-Dio-cmgD与AAV-hSyn-Cre-WPRE-pA混合后，并与辅助病毒AAV-hSyn-Dio-EGFP-T2A- Her2CT9同时注射到C57BL/6小鼠V1区，14天后，将Hs06注射到同一部位。Hs06注射5天后，取脑切片观察。由于Hs06的荧光表达水平较低，作者对脑组织进行了免疫组化处理，进一步放大荧光信号便于成像和观察。在标记结果中，可在上丘(SC)、外侧膝状腹侧区(LGNv)和尾壳核氟(CPU)等脑区观察到红色荧光蛋白，而这些脑区已经被证明只接受了V1的投射，因此进一步证实标记的神经元是由V1脑区的Hs06病毒感染的。另外作者从上丘脑(SC)开始进行示踪实验，发现Hs06标记的神经元在SC中投射到许多区域，包括顶盖前核和LGN，但没有V1区域。这些表明，Hs06可以在Her2CT9和gD的辅助下进行严格顺行跨单突触示踪而不发生逆行感染或跨突触。

图4. Hs06可以作为一种顺行的跨单突触示踪剂

图5.  Hs06不能逆行感染或跨突触

精确描绘输出神经元环路不仅需要给定脑区的输出通路，还需要特定细胞类型神经元的投射信息。在动物中，LH的GABAergic神经元可以投射到大脑多个区域，包括VTA、DBB、PAG，从而参与动物的多种本能行为，如饮食、睡眠和捕食。作者通过Hs06病毒对下丘脑外侧(LH)或腹侧被盖区(VTA) GABAergic神经元的直接输出网络进行了示踪，标记结果表明上述脑区（VTA、DBB、PAG）均接受LH GABAergic神经元投射，VTA的GABAergic 神经元也可投射到许多脑区，如伏隔核（NAc）、苍白球腹侧（VP）、侧钩球（LHB）和中缝背内侧核（DRN），并在压力和奖赏等动物行为中发挥重要作用。再次验证了 Hs06系统的顺行单突触示踪能力，也表明该系统具有相对稳定的示踪能力。

图6. Hs06解析了遗传定义的GABA神经元的直接输出网络

图7.  Hs06病毒系统标记VTA GABA能神经元输出网路的研究