小布解读|稀疏标记——鸡尾酒病毒包装法新应用

时间:2020-12-29 14:08

不同神经元个体间形态结构千差万别,轴树突纤维彼此缠绕,因此常规标记很难揭示群体中单个神经元清晰完整的形态结构以及彼此间的组织关系,这制约了人们理解神经元精细形态结构和神经环路组织构架。稀疏标记方法的开发有助于对大脑神经元进行数目稀少且高亮的标记以研究其中单个神经元的局部树突形态和全脑完整轴突投射

 

2019年7月中科院武汉物理与数学研究所徐富强研究员团队在bioRxiv预印本网站上传了题名为“Recombinase system-dependent copackaging strategy for highly efficient neurocircuit tracing”的研究论文。该论文讲述了一种用于神经元稀疏标记的双包装质粒鸡尾酒法制作重组腺相关病毒的包装方法

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文章指出,由于rAAV载体装载量大小有限,约4.7kb。目前神经环路研究中常用多个分别携带不同外源基因的rAAV病毒混合后共感染神经细胞,实现对神经元的多基因导入。然而不同种类或批次病毒携带不同杂质,具有不同的核衣壳蛋白修饰等原因,导致不同病毒混合感染时相互排斥,影响共感染效果,最终病毒混合物中每个组分的表达水平降低。

 

为了解决上述问题,徐富强团队靳森博士等人开发了一种预混合双核心表达质粒包装单一rAAV集合技术,他们将多种质粒混合后共同转染HEK293细胞,进一步纯化获得单一rAAV集合。以预混合核心表达质粒包装单一rAAV技术为基础,靳森博士等人建立了神经元稀疏高亮度标记方法,通过结合C57bl/6J小鼠或者特定细胞类型神经元表达Cre剪切酶的转基因小鼠,实现了神经元局部树突形态和全脑轴突投射高效标记。结合激光扫描共聚焦显微镜或fMOST全脑切削成像系统,该方法不仅可以研究神经元局部树突形态变化,还可以获取神经元全脑轴突投射形态,从而绘制小鼠大脑不同类型单个神经元全脑水平的投射形态。

 

该方法开发的稀疏标记具有以下优点:

1) 单AAV即可实现稀疏标记。

2) 相比于双病毒混合,该方法稳定性较高。并且每次病毒注射标记的神经元数量相对稳定。

3) 标记细胞数目可控。在一定范围内,神经元标记的数目可控。随着Cre剪切酶的比例逐渐降低,被标记神经元的数量也逐渐减少,但被标记神经元的亮度没有明显变化(相同参数成像),最右三张图片表明注射位点投射到胼胝体的纤维亮度没有明显变化。因此,两种表达质粒混合比例的改变只影响最终被标记神经元的数目,但并不明显影响最终被标记神经元的胞体亮度以及轴突纤维亮度。

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图1. 不同比例质粒混合进行注射的成像结果示意图

 

4) 高亮度标记。神经元的精细形态和长程投射可以被超高亮度地标记出来,并且该策略不管怎么改变Cre质粒浓度,亮度不受影响。不仅仅是胞体,长程的轴突也可以被高亮地标记出来。

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图2. 神经元的精细形态标记

 

5)神经元分离度好。

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图3. 单个神经元标记

 

6) 可进行细胞类型特异性稀疏高亮度标记。通过使用特定类型的Cre转基因动物或者特定类型神经元的启动子,可以高效标记特定类型的神经元。

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图4. 病毒在小鼠大脑基底前脑标记效果

 

7) 可与多项技术联用,例如fMOST、组织透明化、激光共聚焦等,以用于全脑成像和单细胞重建。

 

徐富强老师团队建立的这种新神经元稀疏高亮度标记方法,实现了神经元局部树突形态和全脑轴突投射高效标记。但是在实验中还有一些需注意的地方,比如说转基因小鼠年龄体重性别需尽量选择一致,免疫组化实验中Ⅰ抗、Ⅱ抗孵育时间需增加等。

随着技术的进步,相信不久以后该技术能够逐渐解决这些难题,从而促进人们深入理解大脑神经结构。

 

以上提及的,徐富强老师团队研发的稀疏标记产品均在香港宝典免费资料网有售
 

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时间:2020-12-29 14:08来源:未知 作者:admin8 点击: