盘点 | 在狨猴、小鼠和猕猴大脑皮层中应用哪种AAV血清型更好?

时间:2022-05-09 18:21

腺相关病毒载体(AAV)是将基因递送到中枢神经系统的常用工具之一。AAV的特征之一是具有多种类型的血清型,而不同血清型具有其独特的物种和组织趋向性。迄今为止,AAV血清型对神经系统的转导特性的研究主要针对啮齿动物,但对于非人类灵长类动物的研究相对较少。

狨猴,是体型较小的是新大陆猴,非人灵长类动物,是神经科学研究的良好模型生物。日本Akiya Watakabe科研团队选择狨猴为灵长类动物大脑皮层特异性结构的实验模型,研究并对比了狨猴、小鼠和猕猴的大脑皮层中腺相关病毒载体(AAV)血清型1,2,5,8和9的转导特征
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图1 | PMID: 25240284




 狨 猴 

首先,在成年狨猴大脑皮层中通过立体定位注射不同血清型AAV-CMV-hrGFP,AAV-CaMKII-hrGFP、AAV-SynI-hrGFP,表达三周后检测绿色荧光蛋白hrGFP的表达效率。发现,所有AAV载体都表现出对皮层细胞的有效转导,但不同血清型的病毒传播速度存在相当大的差异,其中AAV2的扩散程度明显低于AAV1/5/8/9。另外,不同启动子hrGFP荧光信号分布也不均匀。
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图2 | 不同AAV在狨猴大脑皮层的表达差异


其次,利用NeuN抗体复染进行神经元鉴定,检测各种AAV血清型的细胞类型偏好和转导效率。结果发现,CMV启动子表达的荧光蛋白(hrGFP)与神经元共标较低,其中血清型AAV2有明显但少量的共标AAV1、5、8和9主要与神经胶质细胞共标,而不同血清型CaMKII-hrGFP与神经元的共标率均高达70%左右,且无明显差异。

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图3 | 不同AAV在狨猴大脑皮层胶质和神经元中的表达



 小 鼠 

进一步比较了狨猴和小鼠之间AAV转导差异。发现在小鼠模型组中,AAV转导总体特征与狨猴相似。AAV2扩散最小,AAV1,8和9在皮层第2、5层的广泛转导。另外CMV启动子表达的荧光蛋白(hrGFP)很少与NeuN细胞共标。
 
小鼠和狨猴主要差异在于AAV转导神经胶质细胞的形态。CMV-hrGFP转导的狨猴神经胶质细胞表现出明显的细胞体和突起,而转导的小鼠神经胶质细胞表现出高度分支的形态,这可能分别对应突胶质细胞形胶质细胞
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图4 | 不同AAV在小鼠皮层的表达差异
 
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图5 | 不同AAV在小鼠大脑皮层胶质和神经元中的表达




 猕 猴 

同时,作者还比较绒猴和猕猴之间AAV转导的特性,AAV转导的总体特征与狨猴之间相似。AAV2扩散最小,但AAV1,8和9在皮层第2、5层的转导不像小鼠或狨猴那样明显

 

CMV启动子表达hrGFP与NeuN细胞共标较低,并在注射8周后,发现组织损伤。相比之下,猕猴皮层中的CaMKII结构没有造成太大的损害,其转导效率高于CMV,与狨猴相似。图6 | 不同AAV在猕猴皮层的表达差异及注射8周后的组织损伤(K-Q)

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图6 | 不同AAV在猕猴皮层的表达差异及注射8周后的组织损伤(K-Q)
 
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图7 | 不同AAV在小鼠猕猴皮层胶质和神经元中的表达




 CMV启动子诱导hrGFP表达引起细胞毒性 

图3L和M中显示一些具有高hrGFP表达的神经元表现出低水平的NeuN信号。猜想高hrGFP表达可能抑制NeuN表达并对神经元产生普遍毒性,因此将狨猴中AAV1、9(CMV-hrGFP)的表达时间延长至六周,发现NeuN信号几乎完全丢失并且胶质细胞渗入感染区域,而CaMKII-hrGFP和SynI-hrGFP 对NeuN表达无不利影响。因此,CMV的高水平转基因表达可能引起细胞毒性
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图8 | CMV构建体的AAV转导毒性





 CaMKII和SynI启动子的细胞类型偏好性 

在狨猴(6周)左半球和右半球注射AAV-CaMKII-hrGFP、AAV-Synl-hrGFP,发现两者荧光强度无明显不同,但CaMKII在整个层中表现出相对均匀的表达,而SynI在皮层第3、5层富集表达

 

进一步测试CaMKII和SynI表达的hrGFP与小白蛋白(PV)的共定位,PV是主要GABA能抑制神经元亚型标志物。对于CaMKII,许多PV阴性神经元和阳性神经元均表达hrGFP;而SynI,皮层第3、5层PV阳性神经元表达hrGFP,与之前小鼠皮层中的发现一致。

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图9 | 不同启动子CaMKII和SynI诱导荧光蛋白表达的区别

 

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图10 | 不同启动子CaMKII和SynI对GABA能神经元的偏好性





 总 结 

综上所述,AAV1、2、5、8和9都可有效地转导狨猴、小鼠和猕猴大脑皮层的神经元。在这些血清型中,AAV2的传播速度往往小于其他血清型。在AAV1/5/8/9中,胶质细胞表达阻碍了CMV构建体对神经元转导。CMV启动子长期表达后可能导致细胞中毒,而启动子CaMKII和SynI表现出相似但略有不同的细胞类型偏好。


 

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时间:2022-05-09 18:21来源:未知 作者:admin8 点击: