盘点 | 在狨猴、小鼠和猕猴大脑皮层中应用哪种AAV血清型更好？

腺相关病毒载体（AAV）是将基因递送到中枢神经系统的常用工具之一。AAV的特征之一是具有多种类型的血清型，而不同血清型具有其独特的物种和组织趋向性。迄今为止，AAV血清型对神经系统的转导特性的研究主要针对啮齿动物，但对于非人类灵长类动物的研究相对较少。

狨猴，是体型较小的是新大陆猴，非人灵长类动物，是神经科学研究的良好模型生物。日本Akiya Watakabe科研团队选择狨猴为灵长类动物大脑皮层特异性结构的实验模型，研究并对比了狨猴、小鼠和猕猴的大脑皮层中腺相关病毒载体（AAV）血清型1，2，5，8和9的转导特征。



 狨 猴 

首先，在成年狨猴大脑皮层中通过立体定位注射不同血清型AAV-CMV-hrGFP，AAV-CaMKII-hrGFP、AAV-SynI-hrGFP，表达三周后检测绿色荧光蛋白hrGFP的表达效率。发现，所有AAV载体都表现出对皮层细胞的有效转导，但不同血清型的病毒传播速度存在相当大的差异，其中AAV2的扩散程度明显低于AAV1/5/8/9。另外，不同启动子hrGFP荧光信号分布也不均匀。


其次，利用NeuN抗体复染进行神经元鉴定，检测各种AAV血清型的细胞类型偏好和转导效率。结果发现，CMV启动子表达的荧光蛋白（hrGFP）与神经元共标较低，其中血清型AAV2有明显但少量的共标，AAV1、5、8和9主要与神经胶质细胞共标，而不同血清型CaMKII-hrGFP与神经元的共标率均高达70%左右，且无明显差异。




 小 鼠 

进一步比较了狨猴和小鼠之间AAV转导差异。发现，在小鼠模型组中，AAV转导总体特征与狨猴相似。AAV2扩散最小，AAV1，8和9在皮层第2、5层的广泛转导。另外CMV启动子表达的荧光蛋白（hrGFP）很少与NeuN细胞共标。
 
小鼠和狨猴主要差异在于AAV转导神经胶质细胞的形态。CMV-hrGFP转导的狨猴神经胶质细胞表现出明显的细胞体和突起，而转导的小鼠神经胶质细胞表现出高度分支的形态，这可能分别对应少突胶质细胞和星形胶质细胞。




 猕 猴 

同时，作者还比较绒猴和猕猴之间AAV转导的特性，AAV转导的总体特征与狨猴之间相似。AAV2扩散最小，但AAV1，8和9在皮层第2、5层的转导不像小鼠或狨猴那样明显。

 

CMV启动子表达hrGFP与NeuN细胞共标较低，并在注射8周后，发现组织损伤。相比之下，猕猴皮层中的CaMKII结构没有造成太大的损害，其转导效率高于CMV，与狨猴相似。图6 | 不同AAV在猕猴皮层的表达差异及注射8周后的组织损伤(K-Q)

 CMV启动子诱导hrGFP表达引起细胞毒性 

图3L和M中显示一些具有高hrGFP表达的神经元表现出低水平的NeuN信号。猜想高hrGFP表达可能抑制NeuN表达并对神经元产生普遍毒性，因此将狨猴中AAV1、9（CMV-hrGFP）的表达时间延长至六周，发现NeuN信号几乎完全丢失并且胶质细胞渗入感染区域，而CaMKII-hrGFP和SynI-hrGFP 对NeuN表达无不利影响。因此，CMV的高水平转基因表达可能引起细胞毒性。




 CaMKII和SynI启动子的细胞类型偏好性 

在狨猴（6周）左半球和右半球注射AAV-CaMKII-hrGFP、AAV-Synl-hrGFP，发现两者荧光强度无明显不同，但CaMKII在整个层中表现出相对均匀的表达，而SynI在皮层第3、5层富集表达。

 

进一步测试CaMKII和SynI表达的hrGFP与小白蛋白（PV）的共定位，PV是主要GABA能抑制神经元亚型标志物。对于CaMKII，许多PV阴性神经元和阳性神经元均表达hrGFP；而SynI，皮层第3、5层PV阳性神经元表达hrGFP，与之前小鼠皮层中的发现一致。

图9 | 不同启动子CaMKII和SynI诱导荧光蛋白表达的区别

 

图10 | 不同启动子CaMKII和SynI对GABA能神经元的偏好性

 总 结 

综上所述，AAV1、2、5、8和9都可有效地转导狨猴、小鼠和猕猴大脑皮层的神经元。在这些血清型中，AAV2的传播速度往往小于其他血清型。在AAV1/5/8/9中，胶质细胞表达阻碍了CMV构建体对神经元转导。CMV启动子长期表达后可能导致细胞中毒，而启动子CaMKII和SynI表现出相似但略有不同的细胞类型偏好。

 

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