时间：2022-06-07 09:16
谷氨酸（Glu）是脊椎动物大脑中含量最丰富的神经递质之一。以细菌周质结合蛋白（PBP）为骨架开发的iGluSnFR及其变体已被广泛应用于神经Glu监测。然而，常用的iGluSnFR及其变体无法区分突触和突触外的谷氨酸信号，如iGluSnFR、sf-iGluSnFR和SF-Venus-iGluSnFR监测谷氨酸信号空间范围均大于平均突触间距。
因此，我们需要一种全新方法，以区分突触和突触外的Glu信号。
美国霍华德休斯医学研究所Kaspar Podgorski课题组通过多重分析筛选，开发了具有突触信号特异性、改进动力学和信噪比的新变体iGluSnFR3.v857，并将其上传至预印本平台《Glutamate indicators with improved activation kinetics and localization for imaging synaptic transmission》一文中。
图1. DOI：10.1101/2022.02.13.480251
iGluSnFR3.v857的特征in vitro
首先，作者及其团队选择SF-Venus-iGluSnFR-A184V（WT）作为模板，通过20轮诱变和筛选，确定了最优变体iGluSnFR3.v857（15个突变vs WT）。
1）更高敏感性：
相较于WT和iGluSnFR3.v82变体，在1、5、10、20和160个动作电位（AP）刺激时，iGluSnFR3.v857激发亮度更高（图2 b）。同时，刺激后iGluSnFR3.v857上升速度更快（图2c）、信噪比更高（图2e）。
图2. 体外培养神经元中iGluSnFR3.v857的特性
2）更好的线性：
反应速率常数（kobs）的停流测量显示WT和iGluSnFR3变体的不同程度的饱和动力学，其中iGluSnFR3.v857更接近线性。
图3. WT及iGluSnFR3变体的反应速率
由于突触释放的概率，以及由此释放的囊泡的平均数量，取决于细胞外Ca2+。使用iGluSnFR3.v857，当胞外Ca2+浓度从1.3 mM增加到3.5 mM时，单轴突终末1 AP的ΔF/F明显增加；而相同条件下，WT作用的单轴突终末反应没有明显增加。这与该指标的饱和动力学结果一致。
图4. WT及iGluSnFR3变体对钙离子浓度的响应
3）更优的空间特异性
破伤风毒素轻链肽（TeNT）可介导神经递质释放的突触前抑制。给予1AP刺激后，iGluSnFR3.v857+TeNT共表达神经元中信号，较单独表达v857大幅降低（图4h右）。而表达WT+TeNT神经元信号则较单独表达A184V神经元上升（图4h左）。这说明iGluSnFR3.v857能够更好区分突触和突触外Glu。
iGluSnFR3.v857改善了突触后的纳米级定位
SnFR 探针家族通过N端插入IgΚ分泌先导序列和C端PDGFR跨膜结构域之间而实现膜定位。因此，作者比较了v857与其他15个C端突变的纳米定位情况。其中两个GPI锚定蛋白（GPICOBL9，GPINGR）和一个Stargazin（SGZ）变体显著增加了SNR、改善了表面转运。
随后将这些变体通过AAV传递至小鼠皮质，并通过GFP、Bassoon和Homer1抗体对突触前膜和突触后膜进行标记。共定位结果显示，对于所有变体，抗GFP标记在膜内的分布是不均匀的，并且在整个树突中出现了标记间隙（图5c），但可清楚地观察到v857对突触后的良好标记（图5d）。
图5. v857的树突和突触免疫标记成像
iGluSnFR3.v857活体成像
接下来，作者在小鼠视觉皮层中进行了iGluSnFR3.v857的活体表征，通过在体荧光成像和电生理验证了上述结果。结果显示，与表达SF-iGluSnFR.A184S的神经元相比，表达v857的神经元的突触表现出更大、更快的1AP相关的瞬态（图6c,d）。同时，与A184S相比，v857在与AP相关的瞬态和非AP相关的事件之间表现出更大的差异（图6e）。剔除成像测量噪声后，上述结果依然显著（图6f）。
小鼠运动刺激实验的结果也与上述描述一致。v857报告的方向调谐反应更多定位在树突棘上，其振幅明显大于SF-iGluSnFR.A184S（图6i,j,k）。
图6. 在视觉皮层的体内双光子谷氨酸成像和电生理学
iGluSnFR3.v857完美响应精确定时的突触活动
最后，作者验证了这种探针对“困难模式”（跨脑区信号传递、深脑区、重复输入的时间滞后）突触活动的响应。
结果显示，v857.GPI对皮质棘突的标记与TC突触的标记同样强烈。这说明v857对深脑区、跨脑区信号传递同样具有高效性。作者还记录了棘突的反应，它主要反映重复项信号输入。通过空间频率分析（图7g）和直接比较平均反应时间（图7h），棘突反应显示了特征性的滞后，不同突触对之间的差异高达70ms。在不同个体上重复这项实验，结果与上述一致，在L4内的平均延迟为17ms。在丘脑腹后核（VPM）标记的小鼠中，密集的轴突网络没有一组异质的时间滞后。这说明v857能够帮助分辨重复信号输入的时间差，也进一步证明了v857对体内突触与突触外信号的高特异性。
图7. 两个选定的活跃棘突的荧光信号的交叉及其时间序列
总结
通过改造，iGluSnFR3.v857提高了在体外和体内的敏感性、信噪比、线性和空间特异性，显示了突触后的纳米定位。
这使以前不可行的研究成为可能。v857有望补充或取代树突Ca2+成像，以记录空间分辨的突触输入模式。同时，v857还解决了单个输入之间几毫秒的时间差异。这些能力对于研究神经元计算和学习背后的突触动力学很有价值。
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