BrainBow | 告别“黑白”时代，彩虹般神经元背后的奥秘

2007年，哈佛大学Jeff W. Lichtman团队在《Nature》上发表《Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system》一文，首次提出了一种名叫“脑虹”（BrainBow）的技术，可以将细胞群标记成许多不同的颜色。通过对不同色彩的分析，前所未有地将复杂环路中单独组件的细节可视化，并能够完成计数、形态观察、环路追踪和网络重构等工作。这些“七彩光芒”照亮了黑暗的大脑，将荧光标记技术带入“彩虹”时代。

那么，这些“七彩光芒”是如何产生的呢？

图1 | 果蝇BrainBow (DOI：10.1038/nmeth.1566)

在一般细胞中，我们似乎没见过很多色彩。让它们发光，需要人工干预引入外源荧光标记，包括荧光蛋白（Fluorescent proteins，FPs）和各种荧光染料等。其中绿色荧光蛋白GFP的发现可谓是海洋的馈赠。上世纪60年代，下村修教授首次在水母中发现GFP，并将它克隆至其他物种中表达。随后，钱永健教授在1995年通过对FP分子的种种改造，得到亮度更高且更稳定的FPs，并大量应用。由此开始“荧光蛋白研究风潮”，通过不断探索和改造，不只是GFP，还有更多颜色的FPs被发现并应用。

在很多情况下，两三种颜色就已经足够使用了。但要想把数量庞大、错综复杂的神经细胞彼此区分开，我们还需要更新的技术。

在此前的研究中，Jeff W. Lichtman团队发表了脑虹的初始版本。BrainBow1.0版本以RFP、YFP和CFP的红黄绿组合，依赖Cre/Lox系统进行神经元标记。其中编码荧光蛋白的基因与单个启动子串联在一起，但只有紧挨着启动子的基因能够表达。RFP紧挨着启动子，因此在默认情况下，细胞发出红色荧光，直至重组发生。Cre介导的重组允许下游基因表达，从而大脑成像“七彩光芒”。随后，研究团队在此基础上不断优化，增加荧光蛋白数量并改善其稳定性和亮度。其中2.0版本和2.1版本翻转FP基因、并通过Cre实现重组和调控目的。

图2 | BrainBow2.0策略及效果图

在随后，该团队又发表了升级版BrainBow3.0系列。

BrainBow 3.0版本采用了光稳定的荧光基团mOrange2、EGFP和mKate2，以解决早期版本中荧光强度较低的问题。但1.0、2.0和3.0的版本中，一个接近启动子的XFP在Cre阴性的细胞中“默认”表达。而在Cre表达有限的情况下，该XFP在大多数细胞中表达，从而减少了重组神经元之间的光谱多样性。因此，在3.0版本的基础之上，作者后续又开发出了更优的3.1和3.2版本。在默认情况下，它们不发出荧光。

在BrainBow 3.1的重组载体中，作者插入了一段突变的YFP（PhiYFP Y65A）以消除内源性荧光，只有当重组发生，切除不发荧光的YFP之后，才能激活下游荧光蛋白。而未经历重组的细胞可通过免疫染色检测截短YFP以表征。在3.1版本的基础上，插入WPRE到每个FP之后的3’未翻译序列中，以提高病毒载体和转基因产生的蛋白质水平。作者将这种包含WPRE的载体命名为BrainBow 3.2。

图3 | BrainBow策略及效果图

由于BrainBow3.1的表达框大于6kb，而AAV载体容量小于5kb，因此作者重新设计了表达框。将法尼基化TagBFP 和 EYFP 或 mCherry 和 mTFP 在突变 Lox 位点之间反向放置，以防与Cre无关的表达，并添加WPRE以增加表达。这种表达策略可实现2种荧光蛋白的三种组合：XFP1、XFP2或者两者都不是。将其组合成两个AAV，每个AAV具有2种XFPs，因此合并感染科产生至少8种颜色。

图4 | AAV-XFP策略及其效果

由于BrainBow的颜色通过混合浓度不同的多个荧光团而成，影响标记的差异化因素会降低最终图像的质量，因此获得高质量的图像是具有挑战性的。在这里，总结了BrainBow成像的指南。

1、样品制备：

①为了尽量减少背景，截面厚度应小于物镜的工作距离。如，对于高数值孔径[NA]镜头，通常为<100μm。

②匹配浸入介质和样品的折射率也很重要，因为这些值之间的不匹配引起的色差会导致颜色通道之间的空间偏移。如，聚乙烯醇醇（如Mowiol 4-88）与油浸（~1.52）物镜更匹配。

2、共聚焦激光扫描显微镜：

共聚焦显微镜更适合于厚标本，因为它们避免了来自聚焦平面外的光污染。强烈建议使用复消色差或萤石显微镜物镜校正三种或更多颜色。同时，重叠的荧光团应按顺序成像，而不是同时成像，以最大限度地减少荧光串扰，从而优化颜色分离。此外，应将激光功率设置得尽可能低，防止因各种原因造成的漂白、颜色变化及信号减少。

3、图像处理：

必须对BrainBow图像进行后处理，以最大限度地利用色彩信息，但需要注意避免引入伪像。例如，具有0.5–2像素半径的中值或高斯模糊可降低色彩噪点，但会降低分辨率。反卷积算法比简单的滤镜更具挑战性，但可以在不影响空间分辨率的情况下消除颜色噪声。

在此，作者提供了一种新的“解题思路”，通过Cre/Loxp策略在AAV载体中表达多种荧光蛋白XFPs的组合BrainBow，以此获得多种颜色的标记。并通过改善系统/策略，获得了更优的多色标记工具BrainBow3.0系列。

凭借如此“大费周章”的细胞调色，我们将能够比以往更详细地观察到各种生物体的单细胞形态和动态，还能将它们与错综复杂的背景区分开来，进而为神经网络连接及其相互作用提供数据和参考。

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