【聚焦】胞体靶向钙指示剂的精确成像

在神经系统研究中，我们常使用钙指示剂表征钙离子浓度变化，以反映神经元的活动。常见的钙成像方法有双光子荧光成像和单光子荧光成像两种，其中后者是研究活体脑神经活动的常用方法。但与双光子成像相比，单光子成像更易受到来自神经元的高水平串扰，导致信噪比降低。不仅如此，采集活动信号时还易被来自近距离通过的轴突和树突的信号所污染，造成显著的非特异性信号，这些均严重影响对神经元活动反应的精准成像。

因而，在单光子荧光成像的基础上，研究团队在细胞核中表达遗传编码的钙指示剂，从而消除神经纤维信号。但与经典的胞质钙成像相比，钙进入细胞核的要求降低了这种成像的时间精度。

为了解决这一问题，麻省理工的研究团队将遗传编码钙指示剂靶定在细胞体附近的细胞质中，构建了荧光钙指示剂GCaMP6f和GCaMP7f的细胞体靶向变体。

图1 海马神经元GCaMP变异体

通过筛选天然与人工合成的融合体，在小鼠与斑马鱼幼虫身上成功得到以肿瘤为靶点的致密神经回路报告，报告显示来自神经纤维的伪信号明显减少，信噪比增加，神经元之间的伪影相关性降低。这些结果均说明GCaMP6f和GCaMP7f的细胞体靶向变体（Soma-GCaMP6f，Soma-GCaMP7f）对提高单光子荧光成像技术的精准性起到着重要作用。

这种胞体靶向突变体对提高神经信号标记的精准性是否具有组织特异性或物种特异性呢？研究团队针对这一问题，分别在小鼠不同脑区以及斑马鱼幼鱼的整胚转染和斑马鱼不同发育时期的信号采集等方面进行研究。

图2 小鼠大脑切片中神经细胞膜串扰的降低

研究者在培养的小鼠海马体神经元表达了细胞体靶向变体，结果表明胞体突变指示剂（Soma-GCaMP6f）相较于天然GCaMP6f指示剂表现出显著的性能优势（其基线亮度约为表达GCaMP6f的5倍），对钙信号采集的特异性显著加强，并减少了对远离胞体的非特异性信号的标记，大大增加了实验精度。

研究者在幼年斑马鱼中也观察到了同样的结果。

图3 斑马鱼幼鱼受精后5天神经元表达信号

此外，针对成像时的瞬态荧光值以及亮度分析，本文也进行了研究。在行为小鼠中，Soma-GCaMP6f的神经纤维荧光显着降低，且降低了附近细胞的高度相关性（即非特异性信号的干扰），降低串扰。

图4 行动小鼠纹状体中SomaGCaMP减少神经纤维污染

同时，表达SomaGCaMP6f2较表达GCaMP6f的小鼠的SNR（每个分子对单个动作电位的荧光响应）高1.4倍，荧光上升和下降的速度更快。

需要说明的是，在不同物种中，这些胞体突变模型具有一定的功能差异性。比如相较于斑马鱼，其在小鼠中具有更好的表现。

但毋庸置疑的是，胞体突变模型系统的构建弥补了单光子成像在精度测量上的劣势。这种技术可以将真实的生理相关性与非生理相关性分离开来进行检测，这对于神经环路等相关领域的研究具有着不可估量的潜在价值。

【参考文献】

1.Shemesh O A, Linghu C, Piatkevich K D, et al. Neuron, 2020, 107: 1–17.
 

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