【聚焦】SPARC——一种新型神经元稀疏标记方法的建立

时间:2020-09-08 15:31

神经生物学研究中,对特定细胞类型神经元进行遗传标记已经成为解剖神经环路最常用的方法,许多实验方法依赖于控制单个动物细胞中特定亚群的基因表达。在啮齿动物中,重组酶Flp和Cre介导的效应子表达开关、它莫昔芬诱导的CreER、脑彩虹Brainbow或带有双重标记的镶嵌分析(MADM),都可以特异地标记神经元的亚群。然而,这些技术多数依赖于重组酶的空间/时间的表达效率,在小鼠和果蝇中,还需要对化学或基因诱导条件进行费力且耗时的摸索。
 
重组酶在不同的细胞类型中表达水平存在差异,随着时间的流逝与更多重组酶的表达,不同类型细胞被标记的比例会发生动态的变化,因此,我们不易对单个类型细胞进行精确标记和操纵。另外,尽管大量优化的Gal4和split-Gal4驱动系列能够靶向单个细胞类型,但选择性操纵和标记复杂的神经元亚群仍然具有挑战性。

 

2020年7月,斯坦福大学Thomas R. Clandinin团队报道了一种基于Gal4-UAS表达系统的稀疏标记技术,该技术通过构建一种双稳态的重组酶依赖性遗传竞争环境,实现对单个细胞亚群的标记和操纵。

 

No.1---Gal4-UAS双元表达体系的构建

 

Gal4 和UAS 都是与酵母半乳糖代谢调控相关的调控因子。其中GAL4是转录调控因子,其转录结合域(BD)与UAS(upstream activating sequence,增强子)序列结合,激活域(AD)和启动子序列结合,从而诱导基因的表达。早在1988 年,Fischer 研究组发现在果蝇中表达Gal4 并不影响其正常生长和发育,并且组织特异性表达的Gal4 能以激活UAS 及其融合的下游目的基因的转录。基于以上Gal4-UAS系统双元表达策略,构建了3个果蝇转基因体系:

图:Gal4-UAS表达系统

 

(1):构建并鉴定出特定神经元及其亚群(如视神经叶包括Mi1、T4、T5、HS等神经元亚群)中表达Gal4的转基因系果蝇;

 

(2):构建nSyb(神经元小突触泡蛋白)启动子的调控之下的PhiC31重组酶质粒nSyb-PhiC31,注射到果蝇胚胎细胞中,利用In-Fusion cloning技术介导位点特异性同源重组构建并筛选PhiC31转基因果蝇系,实现广泛的特异性神经元高效率表达。

-----PhiC31,一种能识别噬菌体attP位点和细菌attB位点并介导位点之间进行不可逆、高效整合的重组酶,作用于噬菌体感染细菌之后溶源的态建立。

 

(3):构建UAS-attp-attb-效应子的质粒载体(文中简称SPARC),并利用CRISPR-HDR技术,将该质粒DNA结合gRNA导入到果蝇基因组特定位点诱发双键断裂后的同源重组修复,实现SPARC的delivery.

 

No.2---SPARC双稳态表达架构的建立

 

接下来,本文研究者设计了SPARC的基本架构:其中PhiC31通过颠倒效应子GCaMP6f编码序列的方向,在GCaMP6f两侧加入了标准的attP和attB序列,使其能够在Gal4驱动下表达;另外,他们还设置了一系列attP突变对照组,分别将attP截断为34个碱基对(bp)的序列(34bp_attP-S)、38bp_attP-I以及60bp_attP-D,其中34bp_attP-S在大肠杆菌中经测试只有7%介导重组。

 

图:a-b) SPARC的基本骨架(本图GCaMP6f为效应子);c)果蝇羽化第2天;d)羽化后第6天(在PhiC31存在的情况下,携带34bp_attP结构的重组以低效率进行,直到全部Mi1神经元陆续被标记)。
 
在标准attP和attB序列驱动下,果蝇羽化后第2天即可观察到所有Mi1神经元中GCaMP6f的表达。然而,当使用34bp_attP驱动时,观察到GCaMP6f在羽化后第2天Mi1中稀疏性表达。这个实验提供了一种策略,可通过截短attP序列降低体内PhiC31重组的效率,实现对SPARC中效应子稀疏性表达,而不需要(如FlpOut)每次通过滴定Flp重组酶控制重组效率。
 

图:三个attP突变组60bp_attP-D,38bp_attP-I, 34bp_attP-S在果蝇脑视叶T4和T5神经元中GCaMP6f的表达率逐渐降低

但是,SPARC在完整的Gal4-nSyb-PhiC31环境中表达显得过于高效和拥挤。为了进一步提高对特定神经元亚群中单个细胞标记的分辨率,研究者引入了双attP位点竞争机制。在其中一个attP位点(可截短)下游加入Stop终止盒元件,让PhiC31在两个attP位点之间做出选择,使SPARC效应子的表达呈现随机且更离散的状态,即SPARC双稳态表达的建立。

图:两个版本的SPARC系统,第一代SPARC即便在有stop终止元件的情况下,仍然存在低水平的转录,尤其在表达其他敏感性更高的UAS-LexA:p65- myr::tdTomato转基因驱动系时会出现强启动子LexAop控制下效应子的表达(myr-tdTomato),即产生所谓的转录本通读(read-through)。因此,本文研究者构建了升级版SPARC 2,在attP和attB之间插入2个自剪切核糖酶HDVR序列,限制了Rxn2稳态条件下因通读产生的干扰效应。

 

为了研究SPARC的功能效用,作者使用SPARC-S-GCaMP6f对单个T5神经元树突进行钙成像。不同于FlopOut方法,需要对果蝇幼虫进行滴定和精确的热休克处理,SPARC可将效应子的表达限制在细胞的亚群上,同时始终标记更少的T5神经元。由于每个T5神经元的树突位置特别接近,并且方向具有不同的选择性,所以单个细胞的稀疏标记对于功能的研究具有重要的意义。


总体来说,本文研究者旨在开发一套工具组合,通过构建attP序列突变和PhiC31/attP-attB竞争性效应子双稳态表达SPARC体系,降低因重组酶在不同细胞亚群中表达时空性带来的动态性偏差,实现对不同类型细胞的稀疏标记和数量预测另外,SPARC还具有广泛的适用性,感兴趣的小伙伴可点击文末左下方阅读原文,也欢迎私信我们一起探讨。

 

 

【参考文献】

1,Jesse Isaacman-Beck et al,. SPARC enables genetic manipulation of precise proportions of cells. Nature Neuroscience volume 23, pages1168–1175(2020)

2,Roumen Voutev and E. Jane Albert Hubbard. A “FLP-Out” System for Controlled Gene Expression in Caenorhabditis elegans. Genetics September 1, 2008 vol. 180 no. 1 103-119

3,Dionne, H., Hibbard, K. L., Cavallaro, A., Kao, J.-C. & Rubin, G. M. Genetic reagents for making split-GAL4 lines in Drosophila. Genetics 209, 31–35 (2018).

4,Thorpe, H. M. & Smith, M. C. In vitro site-specific integration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase/invertase family. Proc. Natl Acad. Sci. USA 95, 5505–5510 (1998).

5,Fischer JA, Giniger E, Maniatis T, Ptashne M. 1988. GAL4 activates transcription in Drosophila. Nature 332:853–856.

 

 

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