小布解读 | 有效治疗脊髓损伤的新策略——敲低多嘧啶束结合蛋白（PTB）

南通大学陈罡团队在《中国神经再生研究（英文版）》上发表论文《Knockdown of polypyrimidine tract binding protein facilitates motor function recovery after spinal cord injury》利用病毒搭载的短发夹RNA（shRNAs）和反义寡核苷酸（ASOs）来敲低多嘧啶束结合蛋白的表达，以确定其在小鼠脊髓反应性星形胶质细胞以及脊髓损伤小鼠模型中的作用。

作者探讨了PTB沉默是否导致反应性小鼠脊髓星形胶质细胞在体外转化为运动神经元。用含有GFAP启动子的慢病毒载体转导小鼠的反应性脊髓星形胶质细胞，以驱动针对小鼠Ptbp1的shRNA的表达。当该载体转导星形胶质细胞2天后， shPTB显著下调了PTB蛋白表达和Ptbp1mRNA表达。在重编程后2周，转导  shPTB的细胞显示出复杂的神经突生长，到4周时，这些细胞显示出明显的神经元形态，而转导shCtrl的细胞显示星形细胞样的扁平和多边形形态。转导3周后， 约41%转导shPTB的GFP阳性细胞显示了神经元标记物MAP2阳性染色。在转化后4周，GFP+ /MAP2+细胞的百分比约为58%，约12% GFP+细胞显示出运动神经元标记物ChAT的表达。相比之下，转导shCtrl慢病毒载体的细胞仅显示出GFP的阳性染色。这些数据表明，反应性脊髓星形胶质细胞可以通过体外PTB沉默被重编程为运动神经元样细胞。

为了确定在脊髓损伤小鼠模型中，PTB沉默是否能补充神经元，包括运动神经元，作者将AAV注射到损伤脊髓区域的斜对侧。用GFAP启动子来驱动shPTB的表达，注射AAV-shPTB后1周，大量GFP+细胞与GFAP+星形胶质细胞共定位，而很少与ChAT+运动神经元共定位，也没有与FoxJ1+神经干细胞共定位。注射11周后，在损伤区域周围一些GFP+细胞与神经元标记物NeuN或MAP2共定位，约19% GFP+细胞表达了运动神经元特异性标记物ChAT。在同一时间点，注射AAV-shCtrl后，损伤区域周围未检测到GFP+神经元样细胞和GFP+运动神经元样细胞。与AAV-shCtrl组相比，AAV-shPTB组的NeuN+、MAP2+和ChAT+细胞数量更为丰富。综上所述，这些结果表明，shPTB可以补充脊髓损伤后损伤区域周围的运动神经元样细胞。

为了确定PTB敲低是否能促进脊髓损伤小鼠的功能恢复，作者利用BMS评分和游泳测试来评估运动功能恢复情况。诱导小鼠发生压缩性脊髓损伤，损伤后1周原位注射AAV-shPTB或AAV-shCtrl。损伤后6-12周，BMS评分、游泳测试和倾斜板试验结果表明，在PTB基因敲除后，肌肉力量的恢复有所改善。冷刺激诱发痛测试或热板试验结果显示，注射AAV-shPTB的小鼠与注射AAV-shCtrl的小鼠相比，其表现没有任何改善。这些结果提示AAV-shPTB治疗可改善脊髓损伤后的运动功能。

如图所示，与对照组相比，PTB-ASO转染组在转染后2天星形胶质细胞PTB蛋白和Ptbp1 mRNA的表达显著降低。转染后5周，通过免疫细胞化学方法评估了重编程细胞的形态、成熟神经元标记物MAP2以及运动神经元标记物ChAT的表达。结果表明，PTB-ASO可显著诱导体外反应性脊髓星形胶质细胞转化为运动神经元样细胞。

作者通过对损伤脊髓的GFAP染色来验证PTB ASOs对脊髓胶质瘢痕密度的影响。在脊髓损伤后12周，对照组注射ASO的小鼠表现出典型的神经胶质瘢痕形态和交错的星形胶质细胞。与对照组相比，PTB ASO注射组小鼠胶质瘢痕来源的星形胶质细胞分布松散，突起较少，胶质瘢痕密度降低。脊髓损伤后12周，与对照组相比，PTB-ASO注射组小鼠病变区域近端区域NeuN+和ChAT+细胞数量更多。TUNEL染色和定量RT-PCR结果表明，PTB-ASO在不破坏其整体结构的情况下适度降低了脊髓损伤区域胶质瘢痕密度，补充了周围运动神经元样细胞，减少了脊髓损伤区域的细胞凋亡。

通过对脊髓损伤小鼠的行为学测试，进一步评估了PTB-ASO的功能。BMS评分、游泳测试和倾斜板试验结果显示，与对照ASO处理组相比，PTB-ASO处理组小鼠脊髓损伤后5-12周运动功能得到了改善。损伤后12周，与对照组相比，PTB-ASO处理组小鼠倾向于使用下肢，并在脊髓损伤后表现出更强的肌肉力量。损伤后6-12周，PTB-ASO处理和对照ASO处理小鼠冷和热诱导的感觉反应没有差异。这些结果表明PTB-ASOs促进脊髓损伤模型小鼠的运动功能恢复。