时间：2022-08-24 20:59
小型近红外(NIR)荧光蛋白(FPs)作为蛋白质标签在成像应用中发挥非常需要的作用。
芬兰赫尔辛基大学Vladislav V. Verkhusha团队在《Nature Methods》上发表《Single-domain near-infrared protein provides a scaffold for antigen-dependent fluorescent nanobodies》一文，首次提出一种17 kDa NIR FP，称为miRFP670nano3，它可以在哺乳动物细胞中发出明亮的荧光，并实现深部脑成像。另外，通过探索miRFP670nano3作为内部标签的功能，作者构建了32 kDa NIR荧光纳米抗体，称为NIR-Fbs，其稳定性和荧光强度依赖于细胞内特定抗原的存在。
NIR-Fbs允许对内源性蛋白质进行无背景可视化，检测病毒抗原，标记表达靶分子的细胞以及用双特异性NIR-Fbs鉴定表达两种抗原的双阳性细胞群。应用NIR-Fbs作为不稳定融合伴侣，研究人员还开发了用于定向降解靶蛋白，调控蛋白表达和酶活性的分子工具。总之，NIR-Fbs能够基于细胞内蛋白质谱来检测和操控各种细胞过程。
在体大脑和脊髓双光子成像
为了评估miRFP670nano3在体内成像中的应用，作者将其克隆为携带hSyn启动子的腺相关病毒(AAV)载体。将载体注射到Cx3cr1GFP/+小鼠的躯体感觉皮层或脊髓背角中，3-5周之后进行双光子成像，结果发现miRFP670nano3在神经元细胞中发出明亮的荧光，而无需外部BV。EGFP的最佳激发波长920nm成像时，整个皮层直到内嗅皮层(约850μm)都能见到miRFP670nano3阳性细胞。研究表明，miRFP670nano3能在哺乳动物细胞中发出明亮的荧光，可用于体内深部组织成像。
图1. 小鼠在体脑和脊髓多重双光子成像
用NIR-Fbs对FP重新着色
作者构建了一种大小为32kDa，内部融合表达miRFP670nano3的荧光纳米抗体(Nbs)，称为NIR-Fbs，利用NIR-FbGFP和NIR-FbmCherry可以对一些转基因小鼠和细胞系中被EGFP或mCherry标记的蛋白重新着色。将EGFP或mCherry标记的β-肌动蛋白和 α-微管蛋白质粒以及大量的NIR-FbGFP和NIR-FbmCherry编码质粒共转染HeLa细胞，结果显示NIR-FbGFP和NIR-FbmCherry与EGFP或mCherry标记的细胞骨架蛋白有很强的共定位关系，并且没有观察到背景信号(图2)。
图2. NIR-Fbs标记HeLa细胞中蛋白质
双特异性NIR-Fbs用于标记双阳性细胞
此外作者还构建了一种双特异性融合体，可以结合两种不同同源抗原EGFP和mCherry的NIR-Fbs(图3a)。研究发现，只有当EGFP和mCherry共表达时产生miRFP670nano3荧光，表明双特异性NIR-FbGFP–NIR-FbmCherry通过与两种抗原结合来稳定结合。相反，当NIR-FbGFP–NIR-FbmCherry单独与EGFP或mCherry共表达时，NIR荧光下降>10倍，表明双特异性融合体被降解(图3b,c)。因此，双特异性NIR-Fbs允许对表达两种目的抗原的双阳性细胞群进行特异性标记。
图3. 双特异性NIR-Fbs标记双阳性细胞
抗原依赖性基因调控
为了证实NIR-Fb介导其融合伴侣的抗原依赖性稳定性，作者构建了NIR-FbmCherry–EGFP融合体，分别评估其在mCherry或mTagBFP2转染细胞中的表达，发现仅在表达mCherry的细胞中观察到EGFP荧光，表明在没有同源抗原的情况下，NIR-FbmCherry和融合伴侣EGFP都被降解。
这种方法被应用于抗原依赖性基因调控中，运用GAL4/上游激活序列(UAS)系统，其中GAL4转录因子能驱动其UAS DNA结合位点下游报告基因的表达。将GAL4融合到NIR-FbGFP(图4d)并将其与编码Gaussia荧光素酶(Gluc)的pUAS-Gluc报告质粒以及EGFP或mTagBFP2共表达。当mTagBFP2代替EGFP共表达时，NIR-FbGFP-GAL4被降解，与EGFP共转染的细胞相比，生物发光信号降低了25倍(图4e0。融合体biNIR-FbGFP-GAL4包含两个 NIR-FbGFP与GAL4融合(图4f)，表现出更强的抗原依赖性，与EGFP表达的细胞相比，共表达mTagBFP2的细胞Gluc信号减少超过50倍(图4f)。
图4. NIR-FbGFP-GAL4融合介导抗原依赖性基因调控
NIR-Fbs用于靶向降解细胞蛋白
作者接下来还研究了NIR-Fb是否可以驱动靶向蛋白质的降解。他们将NIR-FbGFP和biNIR-FbGFP与NbALFA融合，GAL4与ALFA肽融合(图 5g)。结果显示，与表达EGFP的细胞相比，在没有EGFP的情况下，ALFA标记的GAL4和pUAS-Gluc与NIR-FbGFP-NbALFA的共表达导致Gluc信号减少约75%(图 5h)。此外，在没有EGFP的情况下用biNIR-FbGFP-NbALFA共表达，观察到Gluc信号减少了大约85%(图 5i)。这些数据表明，细胞内的蛋白质可以通过与NIR-Fb融合体的结合，实现抗原依赖性降解。
图5. NIR-FbGFP-NbALFA融合介导抗原依赖性蛋白质降解
在这项研究中，作者开发了一种增强的基于蓝细菌光敏色素(CBCRs)的单结构域近红外蛋白，称为miRFP670nano3。通过构建荧光纳米抗体(Nbs)实现了对荧光蛋白重新着色，标记双阳性细胞，以及以抗原依赖的方式降解目标蛋白，调节蛋白表达和激酶活性等目的。
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